追蹤淡水龜的足跡
Translated by Sibbie Li 李曉詩, Edited by Mei Chan 陳美恩, Ivan Lam 林沛賢
Siguiendo las huellas de las tortugas en el agua
Translated and edited by María Teresa NEGREROS AMAYA
Freshwater turtles are one of the most threatened vertebrates in Asia. They are facing extinction due to extensive hunting. Captive turtles are used as traditional Chinese medicine, food, and pets. “But why should we care about turtles?”, you might be wondering. Turtles contribute to ecosystems by nutrient recycling, food web maintenance, and for some species, even seed dispersing.
Luckily, Hong Kong has a unique opportunity for turtle research and conservation as healthy populations still exist in the wild. But sadly, these populations are also declining. For example, the big-headed turtle (Platysternon megacephalum) was once a widespread species in rocky streams but now is scarce. Basic information about turtles’ distribution and abundance is essential to develop effective conservation strategies. However, scientists still do not know the location and number of individuals in the remaining populations. Finding native turtles in the wild is hard in Hong Kong because of their secretive behaviour – most of them live in rocky streams and become active at night only.
Big-headed turtle (Platysternon megacephalum) © Yik Hei SUNG
This is the reason why we, a group of scientists at Lingnan University, used a novel technique called environmental DNA (eDNA) to detect turtles. All organisms have DNA (small molecules of life) and we leave traces of DNA behind in the environment, for example, feces, gametes and shed skin. Using this technique researchers assessed the presence of turtles in Hong Kong streams by detecting turtle’s DNA deposited in the water without the need of visualization. Previous studies have shown the effectiveness of using the eDNA technique to detect rare, secretive species, such as the critically endangered Yangtze softshell turtle (Rafetus swinhoei) and the underground-living Eastern tiger salamander (Ambystoma tigrinum tigrinum), as well as the possibility of estimating species abundance. By developing an eDNA-based protocol our goal is to clarify the turtles’s current distribution and estimate their abundance in Hong Kong, which will then allow us to identify priority sites for research and conservation.
eDNA sampling, featuring Dr. Fong © Itzue Caviedes-Solis
The eDNA project is exciting to start with – analyze small traces of DNA in a fast-flowing stream with thousands of factors that could affect the concentration seems impossible, but it actually works! We first successfully developed a species-specific assay using a technique to amplify small pieces of DNA called quantitative PCR (qPCR) for big-headed turtle. The qPCR technique can amplify traces of eDNA in the environment into a useful amount for further research. We screened water samples from streams over Hong Kong to look for turtles. Surprisingly, apart from sites with known turtle populations, some sites with only historical records and even sites that never had records before showed evidence of turtle.
After we found eDNA from turtles, we tried to confirm their presence by both active searching and regular surveys. We successfully located turtles only in some of the streams where we found eDNA. Furthermore, we compared abundance data from eDNA with a long-term turtle monitoring program. We found that eDNA-based survey has high potential in estimating abundance of turtles in a fast-flowing stream.
Turtle surveying, featuring the author Ivan LAM © Itzue Caviedes-Solis
Developing an eDNA-based survey protocol seems to be straight forward, but we encountered a few difficulties. One of the major challenges was to design protocols to amplify eDNA for different species of turtles using qPCR assays. Although the method is well-documented, we wasted a lot of budget due to unknown causes. In the beginning of the project, we aimed to develop qPCR assays for six turtle species. After detail verification, we succeed only in three turtle species: big-headed turtle (Platysternon megacephalum), Chinese softshell turtle (Pelodiscus sinensis) and the exotic red-eared slider (Trachemys scripta elegans). It is regretful to leave the rest of the threatened species behind. Additionally, in testing environmental water samples, the fluctuation of eDNA concentration was much higher than expected, even in streams with stable populations. The result indicates we need to take more factors, such as environment and ecology of the species into account before estimating abundance, and hopefully breeding season and activity patterns as well.
In the future, we will combine eDNA-based survey with traditional fieldwork for turtle conservation. More resources will be allocated into sites with discovery of turtle population. Since illegal trapping is unfortunately still active in Hong Kong, we hope our findings can suppress further loss of turtles. At the same time, other turtle species, especially the endangered Beale’s eyed turtle (Sacalia bealei) and the critically endangered three-striped box turtle (Cuora trifasciata), are potential targets of future eDNA-based studies.
From left to right: Three-striped box turtle (Cuora trifasciata), Beale’s eyed turtle (Sacalia bealei) and Big-headed turtle (Platysternon megacephalum) © Yik Hei SUNG
We as scientist do our best to help turtles. Being part of this research is important to me because I can have a hand-on experience to conserve endangered species. The enjoyment of nature, the interest in wildlife, and the aesthetic value of turtles are irreplaceable. Moreover, maintaining biodiversity is beneficial to mankind by countless amount of ecosystem services. Conservation is not limited to scientists, everyone can help. For example, we should avoid buying any products from wild turtles, including food and pets in order to reduce the demand. Besides, whenever we encounter a suspicious trap in wild, we can remove it carefully and report to Agricultural, Fisheries and Conservation Department. Although individual effort may not be effective immediately, there will be a desirable outcome over time.
About the author: Ivan LAM earned his Bachelor of Science degree (Major: Ecology & Biodiversity) at Hong Kong University in 2015. He is currently a M. Phil student in the Environmental Science Program at Lingnan University, Hong Kong. He is interested in wildlife observation and photography. In his free time, he loves rambling in the woods no matter day or night, as long as there are animals nearby. He always want to have a nice boat ride but he gets seasick every time. When out of the field, he kills his time by lots of animations and YouTube.
追蹤淡水龜的足跡
Translated by Sibbie Li 李曉詩, Edited by Mei Chan 陳美恩, Ivan Lam 林沛賢
在亞洲，淡水龜是最瀕危的脊椎動物之一。由於人們過度捕獵，牠們正面臨絕種的危機。捕獲的龜會被製成中藥、食品和當作寵物。你可能會好奇，為甚麼我們要關心龜呢？其實，龜對生態系統的貢獻很大，牠們有助養份循環、維持食物鏈平衡、甚至能傳播種子。
幸好香港仍有不少野生淡水龜，為我們提供一個難得的研究和保育機會。令人難過的是，牠們的數目也正在減少。以大頭龜（Platysternon megacephalum）為例，牠曾經是溪澗常見的物種，現在卻十分罕見。要制訂有效的淡水龜保育策略，牠們的分佈和數量等基本資料十分重要。但是，科學家現時仍無法掌握現存種群的位置和數量。由於香港大部份淡水龜都在溪澗生活，而且只會在夜間活動，牠們的行蹤非常隱秘，所以很難在香港的野外找到原生的淡水龜。
大頭龜（Platysternon megacephalum）版權所有 © 宋亦希
這就是為什麼我們這群嶺南大學的科學家使用一種名為環境DNA（eDNA）的新技術來檢測淡水龜。所有生物都有DNA（構成生命的細小分子）。研究人員可以利用淡水龜在環境中留下的DNA，例如糞便、配子（指精子或卵子）和皮屑等來檢測DNA濃度，繼而評估香港淡水龜的情況。先前的研究顯示了eDNA技術對於檢測稀有、隱秘的物種十分有效，例如極危物種斑鱉（Rafetus swinhoei）和生活在地下的東部虎紋鈍口螈（Ambystoma tigrinum tigrinum）。另外，這項技術亦有望估計特定物種的數量。通過制定eDNA檢測方案，我們計劃闡明現時淡水龜在香港的分佈，並估計牠們的數量，繼而制定優先進行研究和保育的地點。
eDNA抽樣 feat. 方博士 版權所有 © Itzue Caviedes-Solis
eDNA項目令人十分興奮—在湍急的水流中分析微量的DNA，當中有數以千計的因素可以影響樣本的濃度，這個看似不可能的任務，實際上竟然可行！我們首先利用即時聚合酶鏈式反應（qPCR）技術，成功開發出淡水龜特異性試劑。qPCR技術能夠放大微量的DNA訊號，將環境中的eDNA訊號擴大，以供進一步研究。我們測試了全港的溪流樣本來尋找淡水龜。令人驚訝的是，除了那些已的出沒地點外，還在一些僅有陳年記錄，甚至從未有過記錄的地點找到了龜的蹤跡。
發現龜的eDNA後，我們透過主動搜索和定期普查來確認牠們的位置。可是，我們只在部份發現eDNA的溪流中成功找到淡水龜。除此之外，我們將eDNA數據與長期監測計劃進行比對。我們發現，eDNA檢測在溪間估計個體數量這方面，潛力無窮。
淡水龜檢測，feat. 作者林沛賢 版權所有 © Itzue Caviedes-Solis
制定一項以eDNA為主的檢測方案看似簡單，我們卻遇到不少困難。其中一大挑戰是設計物種特異性試劑，使用qPCR來擴大不同種類淡水龜的eDNA訊號。儘管設計方法有文獻記載，但因為某些不明的原因，我們浪費了很多預算。項目的初期，我們的目標是用qPCR來檢測六個品種的淡水龜。經過詳細的驗證後，只有三種成功：大頭龜（Platysternon megacephalum）、中華鱉（Pelodiscus sinensis），以及外來的巴西龜（Trachemys scripta elegans）。對於未能納入其餘的受威脅品種，實在頗為遺憾。再者，在檢測水樣本時，即使在淡水龜數量穩定的溪流中，eDNA濃度的波動也遠高於預期。結果表明，在估計個體數量之前，我們需要考慮更多因素，例如物種的環境和生態，以及繁殖期和活動模式等。
在未來的日子裏，我們將會結合eDNA檢測與傳統普查去保育淡水龜。隨著愈多龜群的發現，將有利更多的資源分配。不幸的是，非法捕獵在香港仍然很活躍，希望我們的研究發現能抑制淡水龜群落進一步減少。同時，其他淡水龜品種將會是未來eDNA研究的目標，尤其是瀕危的眼斑水龜（Sacalia bealei）和極危的三線閉殼龜（Cuora trifasciata）。
從左到右：三線閉殼龜（Cuora trifasciata）、眼斑水龜（Sacalia bealei）和大頭龜（Platysternon megacephalum）版權所有 © 宋亦希
我們作為科學家，會竭盡所能來幫助淡水龜。參與這項研究對我而言很重要，因為我可以親身體驗保護瀕臨絕種的動物。大自然、野生動植物的趣味，以及龜的美學價值是獨一無二的。由數之不盡的生態系統服務可見，維持生物多樣性亦有利於人類。保育不只限於科學家，每個人都可以伸出援手。例如，我們應該避免購買任何野生龜的產品，包括食物和寵物，以減少市場需求。另外，當我們在野外發現可疑的捕捉器時，可以小心地拆除它，並向漁農自然護理署報告。儘管個人的努力未必立即有效，久而久之還是會有令人滿意的結果。
關於作者：林沛賢於2015年獲得香港大學理學士學位（主修：生態學與生物多樣性），目前於嶺南大學修讀環境科學哲學碩士。他著迷於觀察和拍攝野生動植物。在空閒時間，無論是白天還是夜晚，只要附近有動物，就喜歡在樹林裡閒逛。他亦常常想乘船出海，但每次都會暈船。在研究以外，會看很多動畫和YouTube片段來消磨時間。
Siguiendo las huellas de las tortugas en el agua
Translated and edited by María Teresa NEGREROS AMAYA
Las tortugas de agua dulce son de los vertebrados más amenazados en Asia, y debido a la casa intensiva se encuentran en peligro de extinción. Las especies en cautiverio son utilizadas para elaborar remedios de medicina tradicional china, comida y también como mascotas. Tal vez te preguntes por qué deberíamos preocuparnos por las tortugas, pues bien, estas contribuyen a los ecosistemas reciclando nutrientes, manteniendo el balance en las cadenas alimenticias y algunas especies, incluso, colaboran con la dispersión de semillas.
Por suerte Hong Kong tiene una oportunidad única en la conservación e investigación sobre tortugas, puesto que aún existen poblaciones saludables en vida silvestre. Aunque lamentablemente dichas poblaciones están también en declive; por ejemplo, la tortuga cabezona (Platysternon megacephalum) fue alguna vez una especie distribuida ampliamente en los arroyos rocosos, pero ahora es escasa.
La información básica acerca de la distribución de las tortugas y su número de individuos es esencial para desarrollar estrategias de conservación efectivas. Pero en muchos casos, los científicos aún desconocen la ubicación y el número de los individuos de las poblaciones que sobreviven. Encontrar tortugas nativas de vida libre en la naturaleza es difícil en Hong Kong, dado que las tortugas tienen un comportamiento reservado y son difíciles de observar. La mayoría viven ocultas en arroyos rocosos y solo se encuentran activas de noche.
Tortuga cabezona (Platysternon megacephalum) © Yik Hei SUNG
Esta es la razón por la que nosotros, un grupo de científicos de Lingnan University, utilizamos una innovadora técnica para detectar tortugas llamada ADN ambiental (eDNA, por sus siglas en inglés). Todos los organismos tenemos ADN (pequeñas moléculas de vida) y dejamos rastros en el ambiente, por ejemplo heces, gametos y las mudas de piel. Con esta técnica estimamos la presencia de tortugas en los arroyos de Hong Kong, y podemos detectar el ADN depositado en el agua sin la necesidad de ver a las tortugas directamente.
Estudios previos han mostrado la efectividad de utilizar la técnica del eDNA para detectar especies raras que permanecen ocultas la mayor parte del tiempo, tales como la tortuga de caparazón blando Yangtze, en grave peligro de extinción, (Rafetus swinhoei) y la salamandra tigre que vive bajo tierra (Ambystoma tigrinum tigrinum). Además, la técnica de eDNA nos ofrece la posibilidad de estimar el número total de especies. Al desarrollar un protocolo basado en el ADN ambiental nuestro objetivo es esclarecer la distribución actual de las tortugas y calcular su abundancia en Hong Kong, lo que posteriormente nos permitirá identificar los sitios prioritarios para la investigación y conservación.
Muestreo de eDNA con el Dr. Fong © Itzue Caviedes-Solis
Es emocionante trabajar en el proyecto de eDNA porque, al considerar los miles de factores que pueden afectar la concentración de ADN en el agua, pareciera imposible que se puedan analizar los rastros de este, ¡pero sí funciona! Inicialmente probamos exitosamente que la técnica para amplificar pequeños trozos de ADN llamada PCR cuantitativa (qPCR, por sus siglas en inglés) funcionaba para las tortugas cabezonas. La técnica de qPCR determina si hay rastros pequeños, casi indistinguibles de ADN en el medio ambiente, y luego los amplifica en mayores cantidades para que puedan analizarse y ser útiles para futuras investigaciones. Examinamos muestras de aguas de arroyos alrededor de Hong Kong para buscar rastros de ADN de las tortugas. Sorprendentemente, además de los sitios con poblaciones conocidas de tortugas, algunos lugares con solo registros históricos, e incluso sitios que nunca han tenido registros, mostraron evidencias de tortugas al analizar el agua de los ríos.
Después de que encontramos el AND de tortugas en el ambiente, tratamos de confirmar su presencia mediante búsquedas activas y mapeos periódicos. Localizamos a las tortugas de forma exitosa solamente en algunos de los arroyos donde encontramos su ADN en el ambiente. Además, comparamos la abundancia de datos de ADN en el agua con un programa de monitoreo a largo plazo. Así descubrimos que las inspecciones basadas en ADN del agua tienen un alto potencial para estimar el número de tortugas en arroyos que tienen corriente rápida.
Busqueda de tortugas, con el autor Ivan LAM © Itzue Caviedes-Solis
Desarrollar un protocolo de mapeo basado en eDNA parece sencillo, pese a esto hemos encontrado algunas dificultades. Uno de los mayores retos fue diseñar protocolos para amplificar el ADN que está en el agua en diferentes especies de tortugas utilizando ensayos de qPCR, ya que aunque el método está bien documentado, nosotros gastamos mucho presupuesto por causas desconocidas. Al inicio del proyecto aspiramos a desarrollar protocolos de qPCR que funcionaran para seis especies de tortugas, desafortunadamente, después de múltiples pruebas para verificar su efectividad, solo tuvimos éxito en tres especies: la tortuga cabezona (Platysternon megacephalum), la tortuga china de caparazón blando (Pelodiscus sinensis) y la exótica de orejas rojas (Trachemys scripta elegans). Es una pena tener que dejar de lado al resto de las especies amenazadas.
A lo anterior hay que agregar que en las muestras de agua que evaluamos, encontramos una variación en las concentraciones de ADN más grande de lo que esperábamos, incluso en arroyos con poblaciones estables de tortugas. Los resultados indican que necesitamos tomar más factores en cuenta antes de estimar su abundancia, tales como el ambiente y la ecología de las especies, y de ser posible, la temporada de reproducción y los patrones de actividad.
En el futuro combinaremos los muestreos de eDNA con el trabajo de campo y búsquedas tradicionales para la conservación de tortugas. Más recursos serán asignados en los sitios donde se descubran poblaciones. Dado que, lamentablemente, la captura ilegal todavía está activa en Hong Kong, esperamos que nuestros hallazgos puedan frenar el declive o la pérdida de más tortugas. Adicionalmente, otras especies, especialmente la tortuga de ojos de Beale (Sacalia bealei) y la tortuga de caja rayada (Cuora trifasciata), ambas especies en peligro crítico de extinción, son objetivos potenciales de futuros estudios basados en eDNA.
De izquierda a derecha: Tortuga de caja de tres rayas (Cuora trifasciata), tortuga de ojos de Beale (Sacalia bealei) y tortuga cabezona (Platysternon megacephalum)© Yik Hei SUNG
Nosotros, como científicos, hacemos nuestro mejor esfuerzo para ayudar a las tortugas. Ser parte de esta investigación es importante para mí porque puedo tener una experiencia práctica en la conservación de especies en peligro de extinción. El disfrute de la naturaleza, el interés por la vida silvestre y el valor estético de las tortugas son insustituibles. Además, el mantenimiento de la biodiversidad es beneficioso para la humanidad por una cantidad incontable de servicios que nos proporcionan los ecosistemas.
La conservación no se limita a los científicos, todos pueden ayudar. Por ejemplo, debemos evitar comprar productos de tortugas salvajes, como alimentos, y adquirirlas como mascotas, esto ayudará a reducir la demanda. Por otro lado, cuando sospechemos haber encontrado una trampa en la naturaleza, podemos retirarla con cuidado e informar al Departamento de Agricultura, Pesca y Conservación. Aunque los esfuerzos individuales pueden parecer no ser efectivos de inmediato, con el paso del tiempo los esfuerzos conjuntos nos acercarán al resultado deseado.
Sobre el autor: Ivan LAM obtuvo su licenciatura en Ciencias (especialidad: Ecología y Biodiversidad) en la Universidad de Hong Kong en 2015. Actualmente es un estudiante de maestría en Filosofía en el Programa de Ciencias Ambientales de la Universidad de Lingnan, Hong Kong. Entre sus intereses se encuentran la observación de la vida silvestre y la fotografía. En su tiempo libre, le encanta pasear por el bosque sin importarle si es de día o de noche, mientras que haya animales cerca. Siempre quiere tener un buen paseo en bote, pero invariablemente se marea. Cuando está fuera de campo, mata el tiempo con un montón de animaciones y YouTube.
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